Diseño y validación de un ensayo de minisecuenciación múltiple para detectar polimorfismos asociados con Síndrome Metabólico / Design and validation of a multiple minisequencing assay to detect polymorphisms associated with Metabolic Syndrome

Resumen Introducción: Es importante identificar los polimorfismos de interés clínico en patologías complejas como el Síndrome Metabólico. Por esto, las metodologías para su evaluación deben estar diseñadas y validadas correctamente, esto permite optimizar recursos y tiempo en la genotipificación y detección correcta de los alelos presentes en los individuos. Objetivo: Diseñar y validar una PCR múltiple, seguida de detección por minisecuenciación, para la genotipificación de ocho polimorfismos de nucleótido simple ubicados en el gen del Receptor Beta 3-Adrenérgico (rs4994 y rs4998), gen de la Apolipoproteina A5 (rs3135506 y rs2075291), gen de la Adiponectina (rs1501299 y rs2241766) y gen del Receptor Activador de la Proliferación de los Peroxisomas tipo gamma (rs1801282 y rs1800571), asociados con el síndrome metabólico. Materiales y métodos: Se diseñaron 24 cebadores para la amplificación y detección de ocho polimorfismos de nucleótido sencillo ubicados en cuatro genes candidatos a estar asociados con el síndrome metabólico, usando el software Primer3®. Dieciséis fueron diseñados para amplificar los polimorfismos y ocho para detectarlos por minisecuenciación. Las estructuras secundarias entre los cebadores se verificaron con el software Autodimer. Los polimorfismos se amplificaron simultáneamente y los fragmentos amplificados se acoplaron a las sondas diseñadas para detectar por minisecuenciación el alelo presente, por medio de bases marcadas con fluorocromos. Finalmente, los alelos fueron detectados por electroforesis capilar en un analizador genético ABI 310 y se interpretaron con el software GeneMapper®. La validación del multiplex se realizó genotipando 20 muestras de individuos, cada uno de ellos autorizó este procedimiento por medio del consentimiento informado. Resultados: Se obtuvieron los perfiles genéticos de los 20 controles genotipados, a partir de la amplificación múltiple, seguida de minisecuenciación, diseñada y validada para detectar los ocho polimorfismos. Conclusión: Se diseñó y validó un ensayo para la detección simultánea de los polimorfismos, ubicados en cuatro genes asociados con el Síndrome metabólico. Los cuales pueden ser empleados como referencia para futuros estudios poblacionales.

Abstract Introduction: It is important to identify the polymorphisms of clinical interest in complex pathologies such as Metabolic Syndrome. Therefore, the methodologies for its evaluation must be designed and validated correctly, this permits optimization of resources and time in genotyping and correct detection of the alleles present in individuals. Objective: To design and validate a multiplex PCR, followed by detection by minisequencing, for the genotyping of eight single nucleotide polymorphisms located in the Beta 3-Adrenergic Receptor gene (rs4994 and rs4998), Apolipoprotein A5 gene (rs3135506 and rs2075291), Adiponectin gene (rs1501299 and rs2241766) and gamma-type Peroxisome Proliferation Activating Receptor gene (rs1801282 and rs1800571), associated with metabolic syndrome. Materials and methods: Twenty-four primers were designed for the amplification and detection of eight single nucleotide polymorphisms located in four candidate genes to be associated with the metabolic syndrome, using the Primer3® software. Sixteen were designed to amplify the polymorphisms and eight to detect them by minisequencing. The secondary structures between the primers were verified with Autodimer software. The polymorphisms were simultaneously amplified, and the amplified fragments were coupled to probes designed to minisequence the present allele using fluorochrome-labeled bases. Finally, the alleles were detected by capillary electrophoresis using an ABI 310 genetic analyzer and analyzed with the GeneMapper® software. The validation of the multiplex was performed by genotyping 20 individual samples, each of them authorized this procedure through informed consent. Results: The genetic profiles of the 20 genotyped controls were obtained, from multiple amplification, followed by minisequencing, designed and validated to detect the eight polymorphisms. Conclusion: An essay was designed and validated for the simultaneous detection of polymorphisms, located in four genes associated with metabolic syndrome, and can used as a reference for future population studies.

Polimorfismo S19W (Ser19Ter) de la APOA5 y su relación con la hipertrigliceridemia en una población de Colombia / S19W polymorphism (Ser19Ter) of APOA5 and its relationship with hypertriglyceridemia in a Colombian population

RESUMEN Introducción: Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son responsables del 29,69% de las muertes en Colombia. Se ha encontrado la hipertrigliceridemia, en diversos estudios como factor de riesgo independiente para la ECV. El polimorfismo S19W (Ser19Ter) de la ApoA5 se ha asociado en algunas poblaciones con la hipertrigliceridemia. Sin embargo, en Colombia esto ha sido poco estudiado. Objetivo: Estimar la asociación entre el polimorfismo S19W y la hipertrigliceridemia en población colombiana. Metodología: Estudio tipo Corte Transversal, con 400 individuos provenientes de Bucaramanga, Colombia. Se cuantificó los TAG y se genotipificaron mediante la técnica de SNaPshot y mini secuenciación. Los resultados fueron analizados utilizando el software de análisis genético Arlequín 3.5.1.2. Resultados: El polimorfismo S19W (Ser19Ter) mostró tres perfiles, CC, GG y CG. El polimorfismo S19W se caracterizó tanto en afectados como en no afectados, mostrando que no existen diferencias significativas en esta distribución cuando se comparan los dos grupos. Discusión: Diversos mecanismos se han propuesto para sustentar la hipertrigliceridemia como un factor de riesgo para ECV, entre los que se cuenta la APOA5. El estudio comprobó que la población estudiada se encuentra en equilibrio de Hardy Weinberg y al genotipo CC como el más frecuente. Los genotipos GG y el GC presentaron valores significativos en el grupo de sujetos afectados, (p<0,01 y p=0,03; respectivamente). Se demostró la existencia de una estrecha relación entre el polimorfismo Ser19Trp y la hipertrigliceridemia (p<0,01). Conclusión: Se pudo demostrar la existencia de una relación entre el polimorfismo Ser19Trp de la Apo A5 con los niveles elevados de TAG (p<0,01).

ABSTRACT Introduction: Cardiovascular diseases (CVD) are responsible for 29.69% of the deaths in Colombia. Several studies have shown that hypertriglyceridemia is an independent risk factor for CVD. ApoA5 gene S19W (Ser19Ter) polymorphism has been associated with hypertriglyceridemia in some populations; however, their influence in Colombia is unknown. Objective: To determine the relationship between S19W polymorphism and hypertriglyceridemia in Colombian population. Methodology: Transversal crossover Studio, included a total of 400 individuals. TAG was quantified and genotyped using the technique SnapShot and mini sequencing. The results were analyzed using genetic analysis software Arlequin 3.5.1.2. Results: S19W (Ser19Ter) polymorphism showed three profiles, CC, GG and CG. The S19W polymorphism was characterized both affected and not affected. There wasn´t significant differences in the distribution when the two groups are compared. Discussion: Various mechanisms have been proposed to support hypertriglyceridemia as a risk factor for CVD, including the APOA5 counted. The study found that the study population is in Hardy Weinberg and CC genotype as the most frequent. The GG and GC genotypes showed significant values in the group of affected subjects (p = 0.002 and 0.03). It demonstrated the existence of a close relationship between the Ser19Trp polymorphism and hypertriglyceridemia (p<0,01). Conclusion: It was possible to demonstrate the existence of a relationship between polymorphism Ser19Trp of ApoA5 with elevated levels of TAG (p<0,01).